活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)只需微創(chuàng)提取,即可看清細(xì)胞“前世今生”
活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的核心是通過(guò)對(duì)活細(xì)胞中的部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行微創(chuàng)提取,并對(duì)極其微量的細(xì)胞質(zhì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)在進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后,依舊保持細(xì)胞的存活和功能,從而可以跟蹤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
◎刁雯蕙 本報(bào)記者 劉傳書(shū)
細(xì)胞是生命的基本單位,了解它的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)不僅有助于我們了解正常的發(fā)育過(guò)程,也對(duì)理解疾病的產(chǎn)生和發(fā)展至關(guān)重要。然而,想要看清細(xì)胞的“前世今生”仍然面臨很大的技術(shù)困難。
8月17日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所研究員陳萬(wàn)澤以共同第一作者身份在國(guó)際頂級(jí)期刊《自然》雜志上發(fā)表長(zhǎng)文,介紹了他們研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際首創(chuàng)的活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(Live-seq),該技術(shù)首次讓單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序后,依然能保持細(xì)胞存活,首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞全基因表達(dá)的連續(xù)觀測(cè)。
“該研究實(shí)現(xiàn)了使用活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)同一個(gè)活細(xì)胞多次分離部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行多次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,表明這一技術(shù)有望在將來(lái)用于構(gòu)建單個(gè)活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組系列變化動(dòng)態(tài)模型。該研究為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供了全新的研究策略,為我們理解生命過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化提供了強(qiáng)有力的手段,是這一領(lǐng)域的又一重大突破。” 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授湯富酬評(píng)論道。
不殺死細(xì)胞就能進(jìn)行測(cè)序
為什么人類體內(nèi)的細(xì)胞擁有的基因組幾乎一樣,但是每個(gè)人卻各不相同呢?基因組中數(shù)萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)與否和表達(dá)程度高低,很大程度上決定了細(xì)胞的種類和功能。
因此,如果知道細(xì)胞不同時(shí)間的基因表達(dá)的變化,就能夠了解細(xì)胞的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)。
當(dāng)前,單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是了解細(xì)胞狀態(tài)的重要手段,通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠看清細(xì)胞現(xiàn)在所有基因的表達(dá)狀態(tài)。但是該技術(shù)在理解細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化方面卻面臨很大挑戰(zhàn)。
“利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來(lái)觀測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的前提,是需要將細(xì)胞裂解,提取其中的RNA來(lái)測(cè)定每個(gè)基因表達(dá)量的高低,但這樣就不可避免地殺死了細(xì)胞?!标惾f(wàn)澤說(shuō)道,“使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),也只能了解到一個(gè)細(xì)胞當(dāng)下的狀態(tài),卻不能了解它的過(guò)去,也無(wú)法知曉它將來(lái)的功能?!?/p>
通過(guò)近7年的努力,陳萬(wàn)澤與合作者開(kāi)發(fā)了活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),其核心是通過(guò)對(duì)活細(xì)胞中的部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行微創(chuàng)提取,并對(duì)極其微量的細(xì)胞質(zhì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)在進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后,依舊保持細(xì)胞的存活和功能,從而可以跟蹤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
論文通訊作者、瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院教授巴特·普朗克(Bart Deplancke)表示,該技術(shù)兼具全基因表達(dá)分辨率和動(dòng)態(tài)解析能力,是目前對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組直接動(dòng)態(tài)測(cè)量、偶聯(lián)細(xì)胞現(xiàn)有狀態(tài)和其后續(xù)表型的唯一解決方案。
歷經(jīng)兩次碰壁終于“吸”出RNA
如何在不殺死細(xì)胞的前提下,看到細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化?
“我們首先想到的是外泌體,它是細(xì)胞向外面吐出來(lái)的小泡,里面有蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)。如果我們把單個(gè)細(xì)胞的外泌體都收集起來(lái),再對(duì)其中的RNA進(jìn)行測(cè)量,或許就可以在一定程度上反映細(xì)胞狀態(tài)而又不殺死細(xì)胞。”陳萬(wàn)澤說(shuō)道。
單個(gè)細(xì)胞中僅有10皮克的RNA,這相當(dāng)于一克的一千億分之一的重量,而細(xì)胞分泌的外泌體中的RNA更是少之又少。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種微流控技術(shù)用以完成單細(xì)胞捕獲、外泌體收集等,但他們發(fā)現(xiàn)由于外泌體中的RNA數(shù)量太少,根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分子水平的觀測(cè)。
隨后,陳萬(wàn)澤嘗試?yán)迷谏茖W(xué)領(lǐng)域非常小眾的原子力顯微鏡來(lái)獲取細(xì)胞中的RNA。它有一個(gè)很尖的硅探針,多用來(lái)檢測(cè)物質(zhì)表面性質(zhì)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)探針進(jìn)行表面活化、修飾、洗脫等改造,讓其能夠把細(xì)胞中的RNA“釣”出來(lái)。
“這種探針很細(xì),對(duì)細(xì)胞的損傷很小,就像魚(yú)鉤一樣,改造后可以把細(xì)胞中的RNA‘釣’出來(lái),并能保證細(xì)胞繼續(xù)存活。我們改造了數(shù)十個(gè)探針后,結(jié)果只在兩個(gè)細(xì)胞上成功‘釣’到了RNA?!标惾f(wàn)澤回憶道,當(dāng)時(shí)購(gòu)買(mǎi)一個(gè)原子力顯微鏡探針需要800美元,研究成本太高,成功率太低,這種情況讓這項(xiàng)研究再次面臨阻礙。
在一次偶然的學(xué)術(shù)交流中,陳萬(wàn)澤與導(dǎo)師了解到,瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的朱麗亞·沃爾特(Julia Vorholt)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一種特殊的原子力顯微鏡,能夠吸出一部分細(xì)胞質(zhì)。
一番交流后,陳萬(wàn)澤團(tuán)隊(duì)與朱麗亞·沃爾特實(shí)驗(yàn)室一拍即合,展開(kāi)了聯(lián)合攻關(guān)。聯(lián)合團(tuán)隊(duì)對(duì)一系列的實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化,解決了RNA降解、低溫下的快速操作、超微量樣品轉(zhuǎn)移、采樣通道清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細(xì)胞等多個(gè)問(wèn)題,保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
聯(lián)合團(tuán)隊(duì)利用重新改造后的活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),對(duì)5種類型共295個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠有效區(qū)分不同類型的細(xì)胞,且平均每個(gè)細(xì)胞能檢測(cè)到約4112個(gè)基因的表達(dá)信息。
僅對(duì)少量的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行測(cè)序,是否就能代表細(xì)胞的狀態(tài)?
“我們平行比較了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與普通的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果高度吻合,證明活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠很好地體現(xiàn)細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)?!标惾f(wàn)澤說(shuō)道。
細(xì)胞的存活率又如何保證呢?
“這種特殊的原子力顯微鏡探針尖端只有幾百個(gè)納米大小,對(duì)細(xì)胞損傷極小。吸取約5%—50%的細(xì)胞質(zhì)后,細(xì)胞體積可以快速恢復(fù)到正常水平,存活率為85%—89%,細(xì)胞能進(jìn)行正常分裂。通過(guò)一系列的功能分析和分子表征,我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)有顯著的影響。”陳萬(wàn)澤表示。
對(duì)此,審稿人在評(píng)審意見(jiàn)中也寫(xiě)道:“由于細(xì)胞測(cè)序后仍舊存活,活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一個(gè)細(xì)胞全基因表達(dá)的連續(xù)測(cè)量。”
細(xì)胞測(cè)序結(jié)果從“高清圖片”到“高清電影”
在細(xì)胞觀測(cè)技術(shù)史上,顯微成像和基因編輯介導(dǎo)的分子記錄等技術(shù)不僅能觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、死亡等過(guò)程,還能觀測(cè)細(xì)胞中的單個(gè)或幾個(gè)基因指標(biāo)。
2009年,單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為更系統(tǒng)全面地定義細(xì)胞類型和狀態(tài)提供了變革性手段。但人們?nèi)匀恢荒苡^察到細(xì)胞的靜態(tài)狀態(tài),無(wú)法連續(xù)觀測(cè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)或者檢查細(xì)胞后續(xù)的表型。
如果將利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)觀測(cè)細(xì)胞,比喻為看一張細(xì)胞在分子水平的高清圖片,那么利用活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)觀測(cè)細(xì)胞,就好比看一部細(xì)胞的高清電影,能夠看見(jiàn)它的“前世今生”。
“活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以回答細(xì)胞怎樣的過(guò)去決定了它的現(xiàn)在,不僅知道細(xì)胞為何存在差異,還知道這些差異從何而來(lái)。”陳萬(wàn)澤介紹。
在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,研究團(tuán)隊(duì)利用活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)直接測(cè)定了同一個(gè)巨噬細(xì)胞在不同時(shí)間的狀態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞起始狀態(tài)的少數(shù)基因的表達(dá)差異和噪音(如Nfkbia、Gsn等)是決定細(xì)胞后續(xù)反應(yīng)差異的重要原因。然而,普通的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)無(wú)法找到這些規(guī)律。
陳萬(wàn)澤表示,盡管活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)仍然存在諸多挑戰(zhàn),需要進(jìn)一步完善,比如低通量、暫不能在體內(nèi)應(yīng)用、在高度極化且mRNA分布不均的細(xì)胞中無(wú)法實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、對(duì)細(xì)胞更多次的采樣還需進(jìn)一步研究等,但該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞連續(xù)觀測(cè),也為單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展帶來(lái)了更多可能性。未來(lái),團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步進(jìn)行深入研究,提高活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的可用性。
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